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[자연과학][공학생물학] 브래드포드 단백질 정량법[The Bradford Method for Protein Quantitati…

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작성일17-12-07 14:52

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각각의 Protein 분자에 결합된 CBBG dye의 수는 대략 Protein 에 있는 양이온 수와 비례한다.
7.595㎚ 파장에서 Standard Solution의 흡광도를 측정한 후 기록한다.
거품이 나지 않도록 천천히 뒤집으며 섞는다. 1시 방해成分으로 알려진 것은 Triton X-100과 황산도데실나트륨(SDS) 이다. CBBG는 사용 전에 증류수로 5배가량 희석 후 여과 단계를 거쳐 실온에서 보관한다. 595nm에서의 흡광도는 단백질의 농도와 비례하게 된다된다.

5. 결과
Standard curve

diluted milk 단백질 농도
1) 비율의 diluted milk : 0.166 〓 166
2) 비율의 diluted milk : 1.79 〓 1790
3) undiluted milk : 6.986 〓 6986

undiluted milk의 단백질 농도가 6986 밖에 안 되는 이유
시료 용액의 흡광도는 대조구의 흡광도에 대한 시료 흡광도의 비율이다.
Standard Soulution을 0㎕, 2㎕, 4㎕, 6㎕씩 tube에 넣는다. CBBG를 사용할 때에는 인산과 메탄올의 혼합물로 된 것을 사용한다.
Bradford 시약을 1㎖씩 ep tube에 7개 넣는다. 그러므로 알고 있는 농도의 표준 시료 용액에 대한 흡광도가 얻어지면 이를 기준으로 standard curve를 완성하여 시료 용액의 농도를 계산할 수 있는 것이다.
diluted milk를 5㎕씩 ep tube에 넣는다.

4. 서론
Bradford Method는 산성 용액에서 불그스름한 갈색을 띄는 Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBBG) 염료의 흡광도 변화를 측정한다.

값 분석
Standard Solution의 농도에 대한 흡광도의 관계를 나타낸 선형회귀모형의 결정계수인 은 BSA 표준용액의 경우 0.9123으로 1에 근접한 값을 나타내었다.
각각 시료를 1.5㎖ cuvettes에 1㎖씩 넣는다. CBBG의 음이온이 단백질의 양이온 부분과 정전기적 인력에 의한 결합을 한다. 하지만 단백질의 종류, 즉 아미노산의…(생략) 조성에 따라 반응 정도가 달라지기 때문에 Standard Soulution의 선택이 매우 중요하다. 그런데, 흡광 물질의 농도가 너무 높거나 너무 낮을 경우에는 흡광도가 베르의 법칙을 따르지 않아, 흡광도를 제대로 측정할 수 없다. CBBG가 free dye형태로 있을 때의 최대 흡광은 465㎚(빨강)이지만, 단백질의 아미노산과 결합하여 anionic form일 때의 최대 흡광도은 595㎚(파랑)인 점을 이용한다. ‘베르의 법칙’이란 기체 또는 용액에 의한 빛의 감쇠는 광로 내의 매질의 양에 의해서만 결정되고 밀도 또는 희석도에 영향을 받지 않는다는 법칙이다. 위 실험에서 undiluted milk의 경우 흡광 물질, 즉 우유의 농도가 너무 높아 흡광도가 제대로 측정되지 못한 것이다. 단백질에 결합한 CBBG는 용액을 갈색에서 푸른색으로 변하게 한다.



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공학 생물학 및 실험 레포트

1. 제목
The Bradford Method for Protein Quantitation

2. 준비물
Bradford 시약
Protein Standard Solution
Spectrophotometer와 Quartz cuvette, Pipet
Milk, 증류수
ep tube
BSA Protein(standard)

3. 실험 과정
Milk를 증류수를 이용하여 , , 원액의 비율로 dilution한다. 농도와 흡광도가 직선으로 비례하였다.
Bradford Method는 매우 빠르고 비용이 낮다는 長點이 있으며, 생체고분자 물질 중 단백질에 매우 특이적이다.
6. 토의 및 건의사항
Standard Solution의 농도에 대한 흡광도의 관계를 나타낸 선형회귀모형의 결정계수인 이 0.9123로 1과 근접하기는 하였으나, 다른 실험 그룹들에




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다.
나머지 시료의 흡광도를 측정한 후 기록한다.

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